紫外可見分光光度法在抗生素類藥物分析中的應(yīng)用
摘要：綜述了近年來(lái)紫外可見分光光度法在抗生素藥物分析中的應(yīng)用，其中包括 內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、 四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類抗生素；并展望了該方法今后的發(fā)展趨勢(shì)。 自1940年青霉素應(yīng)用于臨床以來(lái)，已發(fā)現(xiàn)的抗 生素種類達(dá)千余種，臨床中常用的亦有上百種。據(jù) 報(bào)道，在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家，抗生素的使用量占到所有 藥品的10％左右；而在我國(guó)醫(yī)院的使用量普遍在 30％～50％之間。畜牧業(yè)、漁業(yè)中使用的抗生素更 多，其用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過人類各種抗生素使用量的總和。 準(zhǔn)確測(cè)定生產(chǎn)過程及臨床應(yīng)用的抗生素含量，對(duì)合 理使用抗生素具有重要意義。紫外可見分光光度法 因分析手續(xù)簡(jiǎn)便，儀器簡(jiǎn)單，無(wú)需高價(jià)維護(hù)，能滿足 常規(guī)檢測(cè)需要，在抗生素分析中被普遍使用。近幾 年來(lái)，借助紫外可見分光光度法研究抗生素的論文 就有上百篇，本文就這一時(shí)期的有關(guān)報(bào)道進(jìn)行簡(jiǎn)要 評(píng)述。

1 抗生素的常見分析方法 在抗生素分析檢測(cè)中，目前常用的方法有微生 物檢定法、質(zhì)譜法(MS)及色譜法(包括薄層色譜 TLC、高效液相色譜HPLC、氣相色譜GC、毛細(xì)管電 色譜CEC)等。微生物檢定法元需對(duì)抗生素多種活 性成分進(jìn)行分離，可體現(xiàn)藥品的醫(yī)療價(jià)值，但是也存 在步驟繁瑣、成本高、誤差大等缺點(diǎn)。色譜法，先分 離后檢測(cè)，具有靈敏、準(zhǔn)確，分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，與 MS法聯(lián)用還可提高選擇性和靈敏度。但是， HPLC、GC、MS等儀器昂貴，設(shè)備維護(hù)費(fèi)高，極大地 限制了其普及。紫外可見分光光度法恰恰在經(jīng)濟(jì)、 實(shí)用方面彌補(bǔ)了大型儀器方法的不足；其儀器簡(jiǎn)單， 無(wú)需高價(jià)維護(hù)，分析手續(xù)簡(jiǎn)便，能滿足純藥品常規(guī)分 析的需要，因而在高等院校、醫(yī)院、藥廠等基層單位， UV光度計(jì)的使用率遠(yuǎn)高于色譜法和生檢法。

2 紫外可見分光光度法 紫外可見分光光度法是基于分子內(nèi)電子躍遷而 建立起來(lái)的一種光譜分析方法。其中皿一皿，p-．n共軛 體系的電子躍遷較有實(shí)用價(jià)值，前者能產(chǎn)生較強(qiáng)吸 收峰，后者往往具有增色作用。紫外可見光度法定 量分析的基礎(chǔ)是朗伯一比爾定律：A=cbc。經(jīng)過半個(gè) 世紀(jì)的發(fā)展，紫外可見光度法已經(jīng)形成了一些比較 成熟的測(cè)定方法，如普通光度法常以蒸餾水為參比， 無(wú)需顯色劑，在最大吸收下直接測(cè)定；顯色光度法是 利用被測(cè)物與顯色劑的顯色反應(yīng)，以試劑空白或樣 品空白為參比，在顯色波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定；如果測(cè)定波 長(zhǎng)選擇顯色劑的褪色波長(zhǎng)，則稱為褪色法。對(duì)于多 組分樣品，由于總吸收為各組分吸收的總和，如于兩 波長(zhǎng)分別測(cè)定后，建立方程組，可同時(shí)測(cè)得2個(gè)組分 的含量，此為雙波長(zhǎng)法。對(duì)于吸收出現(xiàn)肩峰的情況， 可先對(duì)吸收曲線進(jìn)行求導(dǎo)處理，再選擇峰值為測(cè)量 點(diǎn)，此為導(dǎo)數(shù)法。其它常用的方法還有雙光束法、示 差法、等吸收法等。

3 抗生素類藥物的結(jié)構(gòu)與光譜吸收 不同作者對(duì)抗生素的分類方法有所不同，顧覺 奮[ ]將抗生素分為5大類：(1) 內(nèi)酰胺類；(2)氨基 糖苷類；(3)四環(huán)素類；(4)大環(huán)內(nèi)酯類；(5)其它類。 本文依據(jù)此分類，并將近年研究較多的喹諾酮類抗 生素單獨(dú)列為一類，簡(jiǎn)述抗生素的結(jié)構(gòu)及紫外吸收 特征。
3．1 II．內(nèi)酰胺類抗生素 分子含有f}-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)，如圖1所示�？谝粌�(nèi) 酰胺環(huán)狀J’1一J’1 吸收在200 nm以下，當(dāng)側(cè)鏈含有其 它顯色或助色基團(tuán)時(shí)，可在200 nm以上產(chǎn)生吸收。 臨床應(yīng)用中絕大多數(shù)口一內(nèi)酰胺類抗生素都有紫外吸 收。 一. ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ ‘ 。�！� . H 圖1 青霉索
3．2 氨基糖苷類抗生素 氨基環(huán)醇與氨基糖縮合而成的苷，分子結(jié)構(gòu)如 圖2所示。其特點(diǎn)是一般不含J’1～J’1共軛體系 但含 多個(gè)羥基和氨基；易溶于水，易形成配合物，可用顯 色法進(jìn)行測(cè)定。常用的顯色劑有Fe3 離子、依文思 藍(lán)、曲利本紅、曲利本藍(lán)、滂胺天藍(lán)等。 NI{2 圖2 慶大霉素
3．3 四環(huán)素類抗生素 以四并苯環(huán)為母核，基本結(jié)構(gòu)如圖3所示，含有 苯環(huán)，且環(huán)外一 O 使共軛體系增長(zhǎng)。通常在 210～250 nm有K帶強(qiáng)吸收，在260～300 nn3．有B 帶強(qiáng)吸收或由Ar--C-~O 共軛引起的強(qiáng)吸收，可直 接進(jìn)行測(cè)定。 圖3 四環(huán)素類抗生索基本結(jié)構(gòu)
3．4 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 以1個(gè)大環(huán)內(nèi)酯為母體，通過羥基，以苷鍵和1 ～ 3個(gè)分子的糖相聯(lián)結(jié)，圖4為紅霉素。多數(shù)大環(huán) 內(nèi)酯抗生素在200～300 nm之間有紫外吸收峰，可 直接進(jìn)行測(cè)定。由于分子常為多羥基結(jié)構(gòu)，因而也 常利用顯色法測(cè)定。 圖4 紅霉素
3．5 喹諾酮類抗生素 喹諾酮類抗生素的基本結(jié)構(gòu)如圖5所示。R及 X的不同，構(gòu)成了不同的品種[ 。分子中含有p-．n， Yl—J’1共軛體系，在紫外均有吸收。 OOH R8 Rl 圖5 喹諾酮類抗生素基本結(jié)構(gòu)
4 紫外可見分光光度法的應(yīng)用
4．1 fI．內(nèi)酰胺類抗生素 8一內(nèi)酰胺類抗生素的吸收往往無(wú)其它干擾，可 不經(jīng)顯色直接測(cè)定含量。李燕航等在這方面做了一 些研究工作，他們用普通法直接測(cè)定了頭孢地 尼 3、頭孢氨芐[ ；用示差法測(cè)定了孢羥氨芐[5 ；用 一階導(dǎo)數(shù)法測(cè)定了頭孢拉定 J�？谝粌�(nèi)酰胺類抗生素 也可用顯色光度法進(jìn)行測(cè)定，杜黎明等對(duì)此進(jìn)行了 一系列研究，他們以四氰基對(duì)苯醌為顯色劑，分別測(cè) 定了頭孢克洛和頭孢噻吩[’ ；以硫酸鐵銨為顯色劑 測(cè)定了頭孢曲松鈉 ]，以苯基熒光酮為顯色劑測(cè)定 了頭孢哌酮鈉 J。 紫外可見分光光度法還可用于臨床配伍藥物。 如李錦璨等在272 nm處考察了注射用頭孢米諾鈉 在5種不同輸注液中的穩(wěn)定性[10]，黃紅瑞等在274 nm處研究了頭孢呋辛鈉注射液與氨茶堿、魚腥草2 種注射液的配伍穩(wěn)定性[11]。
4．2 氨基糖苷類抗生素 該類抗生素?cái)?shù)量種類較多，包括鏈霉素、慶大霉 素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核 糖霉素、小諾霉素、阿斯霉素等。江虹等[12]對(duì)硫酸 慶大霉素、妥布霉素及硫酸新霉素做了一系列研究 工作，發(fā)現(xiàn)在pH 2．8～7．0的條件下，曲利本紅 (TR)與硫酸妥布霉素(T0B)、硫酸慶大霉素(GEN) 和硫酸新霉素(NI、o)等反應(yīng)生成紅色離子締合物， 于570 nnl、392 nnl、392 nnl處產(chǎn)生新的吸收峰，于 498 nnl、498 nnl、502 nm處產(chǎn)生褪色峰；他們用顯色 法、褪色法及雙波長(zhǎng)疊加法分別進(jìn)行研究，并應(yīng)用于 硫酸慶大霉素注射液、復(fù)方硫酸新霉素滴耳液、硫酸 妥布霉素注射液的測(cè)定，結(jié)果滿意。江虹等還發(fā)現(xiàn)， 金屬鑭、GI (或ToB)與水溶對(duì)氮蒽藍(lán)(ABWS)形 成藍(lán)色離子締合物后，具有正吸收峰和負(fù)吸收峰，正 吸收峰位于672 m ，負(fù)吸收峰分別位于610 nnl (GEN)和614 m (Tlm )，表觀摩爾吸光系數(shù)e均大 于10 L·mol-1·cnl_。，可用于注射液及人體尿液中 慶大霉素及妥布霉素含量的測(cè)定[13]。其他方面王 福蘭等以用溴甲酚綠為顯色劑在432 nm測(cè)定了硫 酸卡那霉素【¨ ；湛海粼等以伊文思藍(lán)為顯色劑在 678 nm測(cè)定了硫酸阿米卡星【15 ；陳沛琦等以乙酰 丙酮一甲醛為顯色劑在335 m 測(cè)定了新霉素L16]。
4．3 四環(huán)素類抗生素 四環(huán)素類抗生素如四環(huán)素、金霉素、土霉素、強(qiáng) 力霉素、美他環(huán)素、甲烯土霉素和米諾環(huán)素等曾廣泛 應(yīng)用于臨床，但由于病原菌耐藥性、不良反應(yīng)及人禽 共用的危險(xiǎn)性，本類藥物臨床應(yīng)用已很少，目前主要 用于牲畜飼料添加劑[17]。抗生素會(huì)在牲畜體內(nèi)形 成藥物殘留，藥殘分析是目前研究的熱點(diǎn)，但由于 UV光度法的局限性，近幾年在這方面的研究報(bào)道 僅有幾篇。 陳雅[18]等采用普通光度法，在291 nnl處對(duì)魚 肝油乳劑中的制霉菌素進(jìn)行測(cè)定，線性范圍為6．98 ～ 16．3／lg·mL_。，回收率100．8％，RSD為0．87％。 田益玲【19]等在278 m 對(duì)牛奶中的四環(huán)素進(jìn)行了測(cè) 定，方法線性范圍0．03～115 nag·mL_。，回收率 95．5％-100．5％，RSD為2．1％。
4．4 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素毒性低微，能夠作用于細(xì)菌 細(xì)胞膜，口服方便且價(jià)格較廉，在治療學(xué)上重要性僅 略次于B-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類。臨床常用的有紅 霉素、克拉霉素、阿奇霉素、琥乙紅霉素、羅紅霉素、 吉他霉素等。一些紫外可見光度法在該類藥物的研 究情況列于表1中。這些方法與藥典方法比較，結(jié) 果基本一致，可以應(yīng)用于生產(chǎn)管理及含量檢測(cè)。 表1 大環(huán)內(nèi)酯類抗生生素的測(cè)定
4．5 喹諾酮類抗生素 近年來(lái)利用紫外可見光度法研究該類抗生素的 報(bào)道比較多(見表2)。 對(duì)于有干擾的情況，可以用雙波長(zhǎng)法或選用有 選擇性的顯色劑進(jìn)行處理。如周紅嬌應(yīng)用雙波長(zhǎng)分 光光度新計(jì)算法，以0．1 mol·L-1鹽酸為溶媒，選擇 293．0 nnl為測(cè)定波長(zhǎng),271．5 nm為等吸收波長(zhǎng)，不 經(jīng)分離，直接測(cè)定氧氟沙星葡萄糖注射液中氧氟沙 星的含量，消除了葡萄糖的分解產(chǎn)物5．羥甲基糠醛 (5一Ⅷ )對(duì)氧氟沙星含量測(cè)定的干擾，方法簡(jiǎn)便， 結(jié)果可靠[25]。彭小麗等以中性紅(NR)作為光譜探 針，對(duì)比研究了fi-環(huán)糊精(~-CD)、羥丙基一fi-環(huán)糊精 (HP—fi-CD)、甲基一fi-環(huán)糊精(DM-~-CD)在pH 7．6的 緩沖液中，對(duì)左氧氟沙星(LVFX)、氧氟沙星 (0FLX)客體分子的識(shí)別和LVFX的含量測(cè)定，證 明fi-環(huán)糊精及其衍生物與LVFX和OFLX具有較 強(qiáng)的手性識(shí)別能力，并且該法可用于LVFX含量的 測(cè)定[2 6l。 表2 部分喹諾酮類抗生素的測(cè)定

5 趨勢(shì)和展望 紫外可見光度計(jì)發(fā)展已愈50年，分析方法比較 成熟，新的發(fā)展主要將集中在2個(gè)領(lǐng)域：新試劑及儀 器聯(lián)用。新試劑主要包括顯色劑和增敏劑。目前常 用的顯色劑有雜偶氮類、熒光酮、卟啉類、三氮烯類、 安替比林類、三苯甲烷堿性染料、杯芳烴等幾大類， 這些顯色劑以前主要應(yīng)用于藥物中金屬離子的顯色 測(cè)定，但少數(shù)可能應(yīng)用于有機(jī)藥物。近年報(bào)道用于 有機(jī)藥物分析的顯色物質(zhì)有氯冉酸、紫色素、醌茜 素、茜素磺酸鈉、四氰乙烯、甲酚紅、四氯苯醌、四氰 基對(duì)二次甲基苯醌等。增敏劑包括各種表面活性 劑、高分子聚合物、環(huán)糊精等試劑，在改善光度分析 性能，提高靈敏度方面起著重要作用。紫外可見光 度計(jì)的新發(fā)展主要體現(xiàn)在智能化、微型化、集成化、 高速在線檢測(cè)和儀器聯(lián)用上。聯(lián)用則主要是uV與 HPLC、CEC等高效分離技術(shù)的聯(lián)用。近年來(lái) HPLC在藥物分析中占據(jù)著主要地位，而大多數(shù)商 品儀器仍以Uv光度計(jì)為檢測(cè)器，因而，聯(lián)用技術(shù)也 是紫外可見光度法所關(guān)心的課題。